Chromatin IP (CHIP Assay)

Con questo saggio si possono determinare in vivo le zone del DNA nelle quali si lega uno specifico fattore. Si provoca il cross linking tra proteine e DNA, si lisa, si frammenta agli ultrasuoni, si immunoprecipita con un anticorpo specifico, si staccano le proteine dal DNA precipitato. Tramite PCR quantitativa si confrontano le quantità del frammento di DNA di interesse presente nel precipitato con quello contenuto in un campione che ha subito lo stesso trattamento a parte l'immunoprecipitazione.

PROTOCOLLO 1
PROTOCOLLO 2
 
Rimuovere il terreno dalla coltura cellulare mediante aspirazione
coltura cellulare
Porre le cellule in una soluzione di formaldeide 1%, sminuzzarle con il potter. Incubare per 30 minuti. Aggiungere buffer (PBS con 1% di formaldeide) a 0 °C per 10 minuti. Incubare a 37 °C per 15 minuti.
1 litro di PBS: 8 gr NaCl; 0.2 gr KCl; 1.15 gr Na2HPO4 * 7H2O; 0.2 gr KH2PO4
crosslinking
Lavare la sospensione per 10 minuti in (0.25% Triton, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, and 10 mM HEPES (pH 7.5)).
Lavare la sospensione per 10 minuti in (0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, and 10 mM HEPES (pH 7.5)).
Arrestare la reazione di crosslinking aggiungendo glicina alla concentrazione di 0.125 M.
Lavare le cellule tre volte con una soluzione fredda di PBS 1X, inibitore delle proteasi e inibitore delle fosfatasi. Aggiungere gli inibitori anche nei passi successivi.
Lisare le cellule con (50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 1% (w/v) SDS, 10 mM EDTA).
Incubare a 0°C per 10 minuti.
lavaggio
Sonicare 8 volte per un tempo di 15 secondi ciascuna nel buffer di lisi (1% SDS and 10 mM EDTA). Frammentare la cromatina mediante sonicazione, 4 volte per 10 secondi ciascuna (Livello potenza in 'VirSonic 100' = 4). Dopo ciascuna sonicazione far raffreddare per 50 secondi.
sonicazione sonicazione
Purificare la cromatina dalle parti insolubili microcentrifugando a 15000 giri per 20 minuti.
Diluire la cromatina 1:7 nel buffer di diluizione (70 mM HEPES (pH 7.5), 2.5 mM NaCl, 1.5 mM EDTA, 1.5% Triton, and 0.6% deoxycholate).

Separare i detriti cellulari centrifugando a 10000g a 4°C. Diluire il supernatante 10 volte in (16.7 mM Tris–HCl (pH 8.0), 167 mM NaCl, 1.1% TritonX-100, 1.2 mM Na-EDTA, 0.01% SDS).
Filtrare la sospensione in un filtro a siringa a maglie da 0.45 µm e raccogliere il filtrato in una provettina pre-raffreddata.
lavaggio
Pre-chiarificare gli estratti con preimmune IgG insieme con Sepharose A o biglie di G agarosio per 1 ora a 4C.
Incubare con 4–6 µg di anticorpo specifico a 4°C per l'intera notte.
A 250 l del filtrato stata aggiunta una soluzione al 50% di 50 l di proteina A/G immobilizzata e pre-bloccata su biglie. Tenere in agitazione per 1 ora a 4C. Rimuovere le biglie mediante centrifugazione per 2 minuti a 4C (3000g). 200 l di supernatante sono stati raccolti e messi in una provettina da centrifuga pre-raffreddata.
A ogni provettina aggiungere 2 µl (0.33 µg/µl) di anticorpo AR(PG21).
Incubare per 12 ore a 4°C mantenendo in leggera agitazione.
immunoprecipitazione
Il giorno successivo incubare per 1 ora con 30 µl di biglie di agarosio A o G.
Lavare le biglie due volte con buffer (50 mM HEPES (pH 7.5), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton, 0.5% deoxycholate and 0.15% SDS).
Lavare con LNDET buffer (0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA, and 10 mM Tris (pH 8.0)).
Recuperare i complessi cromatina-anticorpo aggiungendo 60 µl di proteina A/G immobilizzata, incubando la sospensione per 1 ora a 4°C e continuando ad agitare lentamente.
Raccogliere le biglie mediante una veloce centrifugazione e lavarle 4 volte rispettivamente:
1) con il buffer freddo (20 mM Tris–HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM Na-EDTA, 0.1% SDS and 1% TritonX-100). Recuperare le biglie mediante centrifugazione per 1 minuto a 24°C (4000g).
2) una volta a 24°C con il buffer (20 mM Tris–HCl (pH 8.0), 250 mM LiCl, 1 mM Na-EDTA, 0.5% IGEPAL (Sigma) non-ionic detergent and 0.5% sodium-deoxycholate (Sigma)). Recuperare le biglie mediante centrifugazione per 1 minuto a 24°C (4000g).
3) due volte con (10 mM Tris–HCl (pH 8.0), 1 mM Na-EDTA) a temperatura ambiente. Recuperare le biglie mediante centrifugazione per 1 minuto a 24°C (4000g).
lavaggio

recupero
Eluire i complessi DNA-proteine dalle biglie con 30–50 µl di buffer di eluizione (1% SDS, 1 mM NaHCO3).
Diluire con (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA).
Incubare per l'intera notte a 65°C per distaccare le proteine dal DNA.
Trattare con proteinasi K a 100 ng/µl e RNAase A per 1 ora a 55°C.
Risospendere le biglie in buffer TE (10 mM Tris–HCl (pH 7.5), 1 mM Na-EDTA) contenente 0.5% di SDS e Proteinasi K per una concentrazione finale di 0.5 mg/ml).
Incubare per 12 ore a 37°C.
Recuperare il supernatante mediante centrifugazione.
Incubare per 6 ore a 65°C per invertire il crosslinking.
reverse crosslinking
Estrarre con fenolo, precipitare con etanolo, risospendere in 30 µl di acqua pura e autoclavata per PCR. Risospendere le biglie in buffer TE (10 mM Tris–HCl (pH 7.5), 1 mM Na-EDTA) contenente 0.5% di SDS e Proteinasi K per una concentrazione finale di 0.5 mg/ml).
Incubare per 12 ore a 37°C.
Recuperare il supernatante mediante centrifugazione.
Incubare per 6 ore a 65°C per invertire il crosslinking.
Estrarre in fenolo/cloroformio e precipitare in etanolo.
Risospendere il pellet in buffer TE.
estrazione DNA
La PCR viene eseguita con primer marcati radioattivamente (32P).
Gli amplificati sono stati estratti con fenolo, separati in gel di poliacrilamide al 6% e autoradiografati con lastra XAR-5.
I campioni da utilizzare come confronto sono stati trattati con questo stesso protocollo ma non hanno subito immunoprecipitazione.
confronto PCR

Riferimenti:
Liqun Zhang, Mai Johnson, Kim H. Le, Makoto Sato, Romyla Ilagan, Meera Iyer, Sanjiv S. Gambhir, Lily Wu and Michael Carey
Interrogating Androgen Receptor Function in Recurrent Prostate Cancer.
Cancer Research 63, 4552-4560, August 1, 2003

Riferimenti:
Katsuaki Masudaa, Thomas Wernerb, Shilpi Maheshwaria, Matthias Frischb, Soyon Oha, Gyorgy Petrovicsa, Klaus Mayb, Vasantha Srikantana, Shiv Srivastavaa and Albert Dobia.
Androgen Receptor Binding Sites Identified by a GREF_GATA Model.
Journal of Molecular Biology. Volume 353, Issue 4, 4 November 2005, Pages 763-771
bibliografia